肉制品和乳制品等食品因富含蛋白質(zhì)、多糖和脂質(zhì)等營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)而易受到食源性致病菌與腐敗菌的生物污染，特別是大腸桿菌。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，金屬抗菌肽SIF4為金屬陽(yáng)離子抗菌肽，具有較好的胃腸耐受性和熱穩(wěn)定性，對(duì)大腸桿菌具有較好抑菌活性，對(duì)大腸桿菌最小抑菌濃度（MIC）為0.4 mg/L，對(duì)EMP和TCA關(guān)鍵酶有不同程度的抑制作用，可造成細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷和誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)量活性氧自由基，破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能，但SIF4對(duì)大腸桿菌菌體呼吸代謝及能量代謝抑制機(jī)理尚未可知。

鑒于EMP和TCA代謝的普遍性及其對(duì)大腸桿菌能量生成的重要性，湖南化工職業(yè)技術(shù)學(xué)院制藥與生物工程學(xué)院著重從EMP和TCA視角分析金屬抗菌肽SIF4對(duì)大腸桿菌呼吸代謝和能量代謝的影響，以期為SIF4在食源性大腸桿菌的生物防控提供理論支持。

1 對(duì)菌體新陳代謝活力的影響

取4 份菌懸液，分別加入SIF4使其終質(zhì)量濃度為1/2 MIC、MIC和2 MIC（MIC為0.4 mg/L，通過(guò)前期研究確定），以不添加SIF4組為陰性對(duì)照。SIF4對(duì)大腸桿菌細(xì)胞代謝活力影響如圖1所示。對(duì)照組（0 MIC組）菌體新陳代謝活力維持在正常水平，并未出現(xiàn)明顯波動(dòng)，表明菌體能量代謝生產(chǎn)與釋放正常，細(xì)胞新陳代謝活力正常（＞97%）；經(jīng)1/2 MIC、MIC和2 MIC的SIF4處理后，菌體新陳代謝活力顯著下降（P＜0.05），具有新陳代謝活力細(xì)菌占比分別下降至（63.09±2.02）%、（47.45±2.11）%和（28.80±2.03）%，相比對(duì)照組，菌體新陳代謝活力分別下降了35.17%、51.23%和70.41%，表明SIF4對(duì)大腸桿菌菌體新陳代謝有一定抑制作用。前期研究表明，SIF4可能以“毯式”模型破壞大腸桿菌菌體細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，增強(qiáng)細(xì)胞質(zhì)膜通透性，并引起細(xì)胞膜去極化，同時(shí)，SIF4還可導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷并誘導(dǎo)氧化應(yīng)激產(chǎn)生過(guò)量自由基，從而破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)與功能。大腸桿菌新陳代謝過(guò)程中，為其傳遞能量的電子傳遞鏈主要位于細(xì)胞質(zhì)膜內(nèi)表面，當(dāng)菌體細(xì)胞質(zhì)膜受到SIF4刺激與破壞之后，可能喪失為新陳代謝傳遞能量的功能，因此，菌體代謝活力顯著降低。

2 對(duì)菌體呼吸代謝途徑抑制的影響

EMP是大腸桿菌最重要的能量與物質(zhì)代謝途徑，HMP與EMP共同構(gòu)成細(xì)胞糖分解代謝與有關(guān)合成代謝的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉分別是EMP、TCA和HMP途徑的典型標(biāo)準(zhǔn)抑制劑，可抑制相應(yīng)代謝途徑從而降低呼吸代謝速率。

1/2 MIC、MIC和2 MIC組SIF4菌體呼吸抑制率分別為（6.692±0.451）%、（19.387±0.168）%和（25.222±0.326）%，呼吸抑制率與處理劑量呈正相關(guān)關(guān)系，且組間差異顯著（P＜0.05）。碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉組菌體呼吸抑制率分別為（20.719±0.326）%、（24.047±0.165）%和（23.446±0.157）%，組間有顯著性差異（P＜0.05）。如上文所述，當(dāng)SIF4與典型呼吸抑制劑抑制的主要呼吸代謝途徑相差越大時(shí)，由于增效作用，疊加率會(huì)越高，反之亦然，因此，若SIF4與典型抑制劑無(wú)協(xié)同增效作用，則疊加率較小，可由此判定SIF4的呼吸代謝抑制機(jī)理。

碘乙酸、丙二酸和磷酸鈉與SIF4復(fù)配的呼吸疊加率分別為（1 9.982±0.133）%、（27.207±0.178）%和（33.304±0.566）%，碘乙酸和SIF4復(fù)配的呼吸疊加率最低，表明SIF4很可能通過(guò)抑制EMP影響菌體能量與物質(zhì)代謝。前期研究發(fā)現(xiàn)，SIF4主要通過(guò)抑制大腸桿菌EMP的已糖激酶活性來(lái)表現(xiàn)高抗菌活性，本研究結(jié)果與前期研究所發(fā)現(xiàn)糖代謝抑制機(jī)理基本一致。

3 對(duì)菌體細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶的影響

Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶是極其重要的細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶，對(duì)維持細(xì)胞質(zhì)膜通透性、結(jié)構(gòu)完整性、低鈉高鉀胞內(nèi)環(huán)境、靜息電位以及信號(hào)傳導(dǎo)有重要意義，Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶的活性受膜流動(dòng)性影響并受ATP水平調(diào)控。

SIF4對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活性的影響，經(jīng)SIF4處理后，菌體細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力與對(duì)照組相比均顯著降低（P＜0.05），1/2 MIC組、MIC和2 MIC組處理8 h時(shí)Na＋K＋-ATP酶活力比處理4 h時(shí)均有所上升，分別從（30.47±0.92）、（23.69±0.86）、（21.67±0.95）U/mg上升至（31.80±0.91）、（26.03±0.72）、（23.99±0.44）U/mg，特別是MIC組和2 MIC組，組內(nèi)差異均顯著（P＜0.05）；8 h后Na＋K＋-ATP酶活力均顯著下降，可能是由于SIF4處理前期菌體為應(yīng)激適應(yīng)階段，通過(guò)增加細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶活力來(lái)增強(qiáng)菌體呼吸代謝和抵御外界不利環(huán)境；金屬抗菌肽SIF4為金屬陽(yáng)離子抗菌肽，帶正電荷，可與革蘭氏陰性菌細(xì)胞膜上脂多糖（LPS）通過(guò)靜電吸附作用結(jié)合于細(xì)胞膜脂質(zhì)膜中，從而牽引整個(gè)抗菌肽分子進(jìn)入質(zhì)膜，擾亂質(zhì)膜上蛋白質(zhì)與脂質(zhì)的有序排列，通過(guò)“位移”而聚合形成跨膜通道，從而破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)完整性并導(dǎo)致胞內(nèi)容物外溢，進(jìn)而起到抑菌作用，推斷細(xì)胞質(zhì)膜是SIF4重要的抑菌效應(yīng)靶點(diǎn)。TritonX-100組隨處理時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶活力顯著下降，處理12 h時(shí)，Na＋K＋-ATP酶活力由初始的（39.03±1.00）U/mg顯著降低至（2.41±0.67）U/mg（P＜0.05），降幅為93.83%，主要是由于TritonX-100為具有親水和疏水基團(tuán)的非離子型去垢劑，可將膜蛋白從細(xì)胞質(zhì)膜解離，破壞細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)并增強(qiáng)膜通透性。細(xì)胞質(zhì)膜受損會(huì)影響能量代謝和膜內(nèi)外質(zhì)子濃度差，并影響Na＋K＋-ATP酶活性，使基于細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)代謝無(wú)法完成并誘導(dǎo)細(xì)胞提前程序性凋亡。

SIF4對(duì)細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力影響，對(duì)照組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力穩(wěn)定，無(wú)明顯波動(dòng)（P＞0.05）。SIF4處理8 h后，與處理4 h相比，1/2 MIC和MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力略有上升，2 MIC組則呈下降趨勢(shì)。SIF4處理12 h時(shí)，1/2 MIC、MIC和2 MIC組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力由初始的（27.55±0.88）U/mg分別降至（20.27±0.58）、（14.30±0.74）U/mg和（7.65±0.53）U/mg（P＜0.05），降幅分別為26.42%、48.09%和72.23%，可能是由于SIF4破壞了細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)，改變了細(xì)胞質(zhì)膜通透性，使胞內(nèi)Ca2＋、Mg2＋、Na＋、K＋等離子泄露，破壞了膜內(nèi)外離子電動(dòng)勢(shì)，從而使細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著下降；此外，1/2 MIC和MIC組出現(xiàn)短暫Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力升高現(xiàn)象，隨后Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低，可能與菌體應(yīng)激適應(yīng)有關(guān)。有研究表明，胞內(nèi)Ca2＋過(guò)量可損害能量系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能，誘導(dǎo)產(chǎn)生過(guò)量自由基并導(dǎo)致組織與細(xì)胞損傷，因此，Ca2＋Mg2＋-ATP酶活性與細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)完整及細(xì)胞質(zhì)膜氧化損傷有一定關(guān)系。本研究還發(fā)現(xiàn)，TritonX-100組Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力組內(nèi)差異顯著（P＜0.05），這與其具有很強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)破壞作用和影響細(xì)胞質(zhì)膜通透性能力有關(guān)。

4 對(duì)菌體胞內(nèi)ATP生物合成的影響

當(dāng)細(xì)胞質(zhì)膜受損或細(xì)胞凋亡時(shí)，胞內(nèi)ATP含量迅速下降，ATP含量變化能直接反映菌體存活狀態(tài)。初始階段組間胞內(nèi)ATP含量無(wú)顯著差異（P＞0.05）。處理4 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組均存在顯著差異（P＜0.05），但1/2 MIC與MIC組、MIC與2 MIC組組間無(wú)顯著性差異（P＞0.05），而1/2 MIC與2 MIC組存在顯著性差異（P＜0.05），可能與1/2 MIC組處理劑量較低和處理時(shí)間過(guò)短有關(guān)；處理8 h和12 h時(shí)，組間均存在顯著差異（P＜0.05）。本研究還發(fā)現(xiàn)，對(duì)照組培養(yǎng)0～12 h時(shí)，胞內(nèi)ATP酶含量由初始（46.13±0.70）×10-6 μmol/g上升至（67.82±0.70）×10-6 μmol/g，增幅為47.02%，可能與菌體代謝旺盛，需要大量ATP為菌體物質(zhì)代謝提供能量來(lái)源和碳骨架等中間體，以及菌體處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期等因素有關(guān)。TritonX-100組胞內(nèi)ATP酶含量呈明顯降低的趨勢(shì)，從初始的（46.13±0.70）×10-6 μmol/g下降至處理12 h時(shí)的（6.09±0.72）×10-6 μmol/g，降幅達(dá)到86.80%，這與TritonX-100有較強(qiáng)的細(xì)胞質(zhì)膜裂解能力有關(guān)；SIF4處理后，除呼吸代謝受到抑制外，胞內(nèi)ATP含量也呈下降趨勢(shì)，特別是2 MIC組對(duì)胞內(nèi)ATP合成抑制最為明顯，胞內(nèi)ATP含量減少可能與ATP合成速率降低或胞內(nèi)ATP水解加速有關(guān)，或與細(xì)胞質(zhì)膜高度受損導(dǎo)致細(xì)胞質(zhì)膜錨定的能量代謝酶功能受損、細(xì)胞質(zhì)膜滲透性增加以及生物氧化與電子傳遞鏈不可逆受損等有關(guān)，本研究結(jié)果與Santos和Chingaté等報(bào)道結(jié)果相似。

5 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)研究了SIF4對(duì)菌體新陳代謝活力、呼吸代謝途徑、細(xì)胞質(zhì)膜離子通道ATP酶及胞內(nèi)ATP生物合成的影響。結(jié)果表明，金屬抗菌肽SIF4處理可顯著降低菌體新陳代謝活力（P＜0.05），經(jīng)2 MIC SIF4處理后，新陳代謝活力降低了70.41%；SIF4對(duì)菌體有較好的呼吸抑制作用，MIC和2 MIC組呼吸抑制率分別高達(dá)（19.39±0.17）%和（25.22±0.32）%；呼吸疊加率分析結(jié)果表明，SIF4可能通過(guò)抑制EMP影響菌體呼吸代謝；此外，SIF4處理后，大腸桿菌細(xì)胞質(zhì)膜離子通道Na＋K＋-ATP酶和Ca2＋Mg2＋-ATP酶活力顯著降低（P＜0.05），推斷細(xì)胞質(zhì)膜是SIF4重要的抑菌效應(yīng)靶點(diǎn)；處理8 h和12 h時(shí)，實(shí)驗(yàn)組組間胞內(nèi)ATP含量均存在顯著差異（P＜0.05），胞內(nèi)ATP含量降幅最明顯，特別是2 MIC組，可能與細(xì)胞質(zhì)膜受損、ATP合成減少或消耗增加、細(xì)胞質(zhì)膜通透性增加等因素有關(guān)。

相關(guān)鏈接：大腸桿菌，碘乙酸，丙二酸，磷酸鈉，Ca₂，Mg₂，蛋白酶，偉業(yè)計(jì)量

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